The level of ascorbate peroxidase is enhanced in benznidazole-resistant populations of Trypanosoma cruzi and its expression is modulated by stress generated by hydrogen peroxide

Ascorbate peroxidases (APX) are class I heme-containing enzymes that convert hydrogen peroxide into water molecules. The gene encoding APX has been characterized in 11 strains of Trypanosoma cruzi that are sensitive or resistant to benznidazole (BZ). Bioinformatic analysis revealed the presence of two complete copies of the T. cruzi APX (TcAPX) gene in the genome of the parasite, while karyotype analysis showed that the gene was present in the 2.000-kb chromosome of all of the strains analyzed. The sequence of TcAPX exhibited greater levels of similarity to those of orthologous enzymes from Leishmania spp than to APXs from the higher plant Arabidopsis thaliana. Northern blot and real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analyses revealed no significant differences in TcAPX mRNA levels between the T. cruzi strains analyzed. On the other hand, Western blots showed that the expression levels of TcAPX protein were, respectively, two and three-fold higher in T. cruzi populations with in vitro induced (17 LER) and in vivo selected (BZR) resistance to BZ, in comparison with their corresponding susceptible counterparts. Moreover, the two BZ-resistant populations exhibited higher tolerances to exogenous hydrogen peroxide than their susceptible counterparts and showed TcAPX levels that increased in a dose-dependent manner following exposure to 100 and 200 µM hydrogen peroxide.

Estudos dos genes que codificam as proteinas antioxidantes em populações do Trypanosoma cruzi Sensíveis e resistentes ao Benzonidazol

O sistema de defesa antioxidante nos tripanosomatídeos é um potencial alvo para quimioterapia. Este sistema é baseado no tiol de baixa massa molecular “tripanotiona”, que mantêm o ambiente intracelular reduzido pela ação da tripanotiona redutase (TR). As vias que metabolizam o peróxido de hidrogênio em moléculas de água envolvem as enzimas triparedoxina peroxidase citosólica (cTcTXNPx) e mitocondrial (mTcTXNPx) e a ascorbato peroxidase (APX). No presente trabalho, os. genes que codificam as enzimas antioxidantes cTcTXNPx, mTcTXNPx, APX e TR foram caracterizados em 18 populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol (BZ). Nossos resultados mostraram que os níveis de mRNA dos genes cTcTXNPx e mTcTXNPx foram duas vezes. maior na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ (17LER), do que seu par sensível (17WTS). No entanto, estes genes não estão amplificados no genoma do parasito. Os genes cTcTXNPx e mTcTXNPx podem apresentam oito e duas cópias, respectivamente, dispersas ao longo do genoma do parasito. Análises de western blot, utilizando anticorpos policlonais anti-cTcTXNPx e anti-mTcTXNPx, mostraram que o nível de expressão destas proteínas nativas foi similar para todas as amostras, exceto na população 17LER que apresentou um aumento de duas vezes na expressão. Além disto, a proteína oxidada mTcTXNPx demonstrou uma expressão 5.5 vezes maior na população 17LER, comparada ao par sensível. Análises filogenéticas das proteínas do T. cruzi cTcTXNPx e mTcTXNPx com outros tripanosomatídeos mostraram que elas estão estreitamente relacionados com seus homólogos em T. brucei.

A enzima APX do T. cruzi pode ser considerada um bom alvo para drogas, uma vez que ela não é encontrada em hospedeiros mamíferos. O nível de mRNA e número de cópias do gene TcAPX não apresentaram diferenças significativas entre as populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. O gene TcAPX pode apresentar duas cópias dispersas ao longo do genoma do parasito e está localizada em uma banda cromossômica em todas as cepas do parasito analisadas A proteína TcAPX apresentou maior similaridade com a APX de espécies de Leishmania, quando comparada com plantas. Observamos que o nível de expressão da proteína TcAPX foi duas. vezes maior na população do T. cruzi com resistência selecionada in vivo ao BZ (BZR), do que seu par sensível (BZS). A tripanotiona redutase é a enzima chave do parasito que mantêm o ambiente. intracelular reduzido. O nível de mRNA e o número de cópias do gene TR não apresentaram diferenças significativas nas amostras analisadas. Este gene apresenta uma única cópia no genoma do. parasito e está mais relacionado com a TR de T. brucei, comparado com outros tripanosomatídeos. Baseado nos nossos resultados, sugerimos que a população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ exibe um aumento no nível da proteína TXNPx juntamente com outras enzimas associadas com o sistema de defesa antioxidante, como a TcFeSOD-A previamente descrita (Nogueira et al., 2006), protegendo estes parasitos resistentes contra o estresse oxidativo

Estudos dos genes que codificam as proteinas antioxidantes em populações do Trypanosoma cruzi Sensíveis e resistentes ao Benzonidazol / Studies of the genes encoding the antioxidant proteins in populations of Trypanosoma cruzi sensitive and resistant Benznidazole

O sistema de defesa antioxidante nos tripanosomatídeos é um potencial alvo para quimioterapia. Este sistema é baseado no tiol de baixa massa molecular “tripanotiona”, que mantêm o ambiente intracelular reduzido pela ação da tripanotiona redutase (TR). As vias que metabolizam o peróxido de hidrogênio em moléculas de água envolvem as enzimas triparedoxina peroxidase citosólica (cTcTXNPx) e mitocondrial (mTcTXNPx) e a ascorbato peroxidase (APX). No presente trabalho, os. genes que codificam as enzimas antioxidantes cTcTXNPx, mTcTXNPx, APX e TR foram caracterizados em 18 populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol (BZ). Nossos resultados mostraram que os níveis de mRNA dos genes cTcTXNPx e mTcTXNPx foram duas vezes. maior na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ (17LER), do que seu par sensível (17WTS). No entanto, estes genes não estão amplificados no genoma do parasito. Os genes cTcTXNPx e mTcTXNPx podem apresentam oito e duas cópias, respectivamente, dispersas ao longo do genoma do parasito. Análises de western blot, utilizando anticorpos policlonais anti-cTcTXNPx e anti-mTcTXNPx, mostraram que o nível de expressão destas proteínas nativas foi similar para todas as amostras, exceto na população 17LER que apresentou um aumento de duas vezes na expressão. Além disto, a proteína oxidada mTcTXNPx demonstrou uma expressão 5.5 vezes maior na população 17LER, comparada ao par sensível. Análises filogenéticas das proteínas do T. cruzi cTcTXNPx e mTcTXNPx com outros tripanosomatídeos mostraram que elas estão estreitamente relacionados com seus homólogos em T. brucei.

A enzima APX do T. cruzi pode ser considerada um bom alvo para drogas, uma vez que ela não é encontrada em hospedeiros mamíferos. O nível de mRNA e número de cópias do gene TcAPX não apresentaram diferenças significativas entre as populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. O gene TcAPX pode apresentar duas cópias dispersas ao longo do genoma do parasito e está localizada em uma banda cromossômica em todas as cepas do parasito analisadas A proteína TcAPX apresentou maior similaridade com a APX de espécies de Leishmania, quando comparada com plantas. Observamos que o nível de expressão da proteína TcAPX foi duas. vezes maior na população do T. cruzi com resistência selecionada in vivo ao BZ (BZR), do que seu par sensível (BZS). A tripanotiona redutase é a enzima chave do parasito que mantêm o ambiente. intracelular reduzido. O nível de mRNA e o número de cópias do gene TR não apresentaram diferenças significativas nas amostras analisadas. Este gene apresenta uma única cópia no genoma do. parasito e está mais relacionado com a TR de T. brucei, comparado com outros tripanosomatídeos. Baseado nos nossos resultados, sugerimos que a população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ exibe um aumento no nível da proteína TXNPx juntamente com outras enzimas associadas com o sistema de defesa antioxidante, como a TcFeSOD-A previamente descrita (Nogueira et al., 2006), protegendo estes parasitos resistentes contra o estresse oxidativo

O gene da enzima ferro-superóxido dismutase-A (TcFeSOD-A) está amplificado numa população de Trypanosoma cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol / The gene of the enzyme iron-superoxide dismutase-A (TcFeSOD-A) is amplified in a population of Trypanosoma cruzi with induced drag in vitro to benzonidazol

A enzima Superóxido Dismutase (SOD) remove o excesso do ânion superóxido via dismutação para oxigênio e peróxido de hidrogênio, componente central da defesa antioxidante dos organismos. Em T. cruzi foi descrita a presença de duas isoformas dessa enzima, TcFeSOD-A e TcFeSOD-B (Ismail et al., 1997). Murta et al. (2002) utilizando a metodologia de Representação da Expressão Diferencial (RDE) selecionaram o gene TcFeSOD-A, que foi superexpresso na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol (BZ) 17LER, comparado com seu par sensível 17WTS. O gene TcFESOD-A, foi caracterizado em 25 populações e clones do T. cruzi sensíveis, resistentes ou com resistência induzida in vitro, ou selecionada in vivo ao BZ. Análise de Northern blot com a sonda do gene TcFeSOD-A, mostrou a presença de dois transcritos um de 1,2 Kb e outro de 1,6 Kb para todas as amostras de T. cruzi analisadas. A população 17LER apresentou nível de mRNA três vezes maior em comparação com seu par sensível (17WTS). A mesma diferença no nível de mRNA foi observada por RT-PCR quantitativo em tempo real. As outras populações do T. cruzi apresentaram os mesmos níveis de mRNA, independente do fenótipo de resistência a drogas. O número de cópias estimado por Southern blot mostrou que o gene TcFeSOD-A está localizado em um ou dois cromossomas, dependendo da cepa do parasita e não está associado com a resistência a drogas. O gene da TcFeSOD-A está presente em duas bandas cromossômicas que foram duas vezes mais intensas na população 17LER do que na 17WTS, confirmando os resultados de Southern blot. Análises de Western blot, mostraram que o anticorpo policlonal anti-TcFeSOD-A recombinante reconheceu um polipeptídeo de 23 kDa em todas as amostras de T. cruzi analisadas. A intensidade desse polipeptídeo foi similar em todas as amostras, exceto na população 17LER, que apresentou duas vezes mais expressão comparado com a 17WTS. Em concordância com esses dados, a atividade enzimática...

O gene da enzima ferro-superóxido dismutase-A (TcFeSOD-A) está amplificado numa população de Trypanosoma cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol / The gene of the enzyme iron-superoxide dismutase-A (TcFeSOD-A) is amplified in a population of Trypanosoma cruzi with induced drag in vitro to benzonidazol

A enzima Superóxido Dismutase (SOD) remove o excesso do ânion superóxido via dismutação para oxigênio e peróxido de hidrogênio, componente central da defesa antioxidante dos organismos. Em T. cruzi foi descrita a presença de duas isoformas dessa enzima, TcFeSOD-A e TcFeSOD-B (Ismail et al., 1997). Murta et al. (2002)utilizando a metodologia de Representação da Expressão Diferencial (RDE) selecionaram o gene TcFeSOD-A, que foi superexpresso na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol (BZ) 17LER, comparado com seu par sensível 17WTS. O gene TcFESOD-A, foi caracterizado em 25 populações e clones do T. cruzi sensíveis, resistentes ou com resistência induzida in vitro, ou selecionada in vivo ao BZ. Análise de Northern blot com a sonda do gene TcFeSOD-A, mostrou a presença de dois transcritos um de 1,2 Kb e outro de 1,6 Kb para todas as amostras de T. cruzi analisadas. A população 17LER apresentou nível de mRNA três vezes maior em comparação com seu par sensível (17WTS). A mesma diferença no nível de mRNA foi observada por RT-PCR quantitativo em tempo real. As outras populações do T. cruzi apresentaram os mesmos níveis de mRNA, independente do fenótipo de resistência a drogas. O número de cópias estimado por Southern blot mostrou que o gene TcFeSOD-A está localizado em um ou dois cromossomas, dependendo da cepa do parasita e não está associado com a resistência a drogas. O gene da TcFeSOD-A está presente em duas bandas cromossômicas que foram duas vezes mais intensas na população 17LER do que na 17WTS, confirmando os resultados de Southern blot. Análises de Western blot, mostraram que o anticorpo policlonal anti-TcFeSOD-A recombinante reconheceu um polipeptídeo de 23 kDa em todas as amostras de T. cruzi analisadas. A intensidade desse polipeptídeo foi similar em todas as amostras, exceto na população 17LER, que apresentou duas vezes mais expressão comparado com a 17WTS. Em concordância com esses dados, a atividade enzimática da TcFeSO...